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平板克隆形成


       平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。


实验方法:

       取对数生长期的单层培养的XXX细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5%CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2~3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL,固定15min。然后去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10~30min,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于50个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

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