1 划痕

       肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力，本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，利用细胞划痕法测定了肿瘤细胞的运动特性。

实验方法：

       将细胞密度为5~10×10⁵个/mL的XXX细胞铺于24孔板（每孔500 μL）上，加入含10%胎牛血清的RMPI.1640培养液，培养16~24h，使形成单层细胞。用10μL移液枪枪头（或者无菌牙签）在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS清洗3次，孵育24h后换成含10%胎牛血清的RMPI.1640培养液，孵育24h。观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2 细胞粘附

       细胞粘附实验通常分为两类，即细胞与细胞粘附和细胞与基质粘附。机体内许多细胞，如上皮细胞固定在某处发挥功能；另一些细胞，如白细胞，活跃运动，就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力，提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。

实验方法：

       用10 μg/mL的纤连蛋白(fibronectin,FN)预铺96孔板，70 μL/孔，4℃过夜后，PBS洗3遍，再用1% BSA于37℃封闭1h，PBS洗3遍。将待测XXX细胞培养至对数生长期，消化细胞，用无血清培养基悬浮细胞，调整浓度为5×10⁵/mL分别接种于预铺FN的96孔板中，每孔5000个细胞，每组设3个复孔。37℃孵育1h后，PBS洗去未黏附的细胞。

检测方法1：

       3.5%戊二醛于4℃固定0.5h，PBS洗3遍；0.1%的结晶紫染色，室温静止0.5h，PBS洗3遍，每孔加入100 μL 10%的乙酸，5~10min后用酶标仪检测595nm的吸光度值，用以表示黏附细胞的多少。

检测方法2：按照每孔加入100μL甲醇，固定15 min每孔加入100 μL吉姆萨染液，染色15min，PBS洗去染液倒置显微镜下随机取5个随机视野计数粘附细胞数量病拍照，统计结果。

检测方法3：MTT法或CCK-8检测细胞量。

3 Transwell迁移

       细胞迁移实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的XXX细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验方法：

       所有细胞培养试剂和Transwellchamber放在37℃温育。待测XXX细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×10⁵/mL。在下室（即24孔板底部）加入600－800μL含10%血清的培养基，上室加入100－150μL细胞悬液，继续在孵箱培养24小时。用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μL甲醇的孔中，室温固定30 min。取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μL Giemsa染液的孔中，室温染色15－30 min。轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片。显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。

4 Transwell侵袭

       所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。

实验方法：

       基质胶准备：将冻存于－80℃冰箱的BD matrigel 4℃过夜（24h），变成液态。取300μL无血清培养基，加入60μL（或50μg/每室）Matrigel，4℃混匀，加入上室各100μL（3个室），放入37℃培养箱中，孵育4-5h。当出现“白色层”时，说明已经变为固态。消化XXX细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液。用无血清培养基洗Matrigel洗1次，每孔加入100μL细胞悬液。下腔室中加入500μL含有20%FBS条件培养基。37℃培养箱中，孵育20-24h。取出transwell用PBS洗2次，5%戊二醛4℃固定。加入0.1%结晶紫染色或Giemsa染色，室温染色5－10min，0.5h，PBS洗2次，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。