实验原理及技术背景1：

       原位杂交组化（ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使其有特异序列的单链探针通过碱基互补配对规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放射性标记发是通过酶促反应将标记的核苷酸掺入DNA中，常用的同位术标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I、³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背景较为清晰等优点，但是由于反射性核素对人和环境均会造成伤害，近年来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。

 

实验步骤：

杂交与显色

       1、将加入探针的杂交液先于50℃预热，均匀涂于切片表面，加上硅化盖玻片，放于湿盒中，50℃孵育12-16h。

       2、1×SSC（含50%甲酰胺），50℃洗涤2次，每次10min。

       3、2×SSC（含50%甲酰胺），37℃洗涤10min。

       4、2×SSC（0.5ug/ml RNaseA），37℃洗涤30min。

       5、1×SSC，50℃洗涤10min。

       6、1×PBS（含0.1%Tween20），50℃洗涤2次，每次10min。

       7、PBT室温洗涤10min。

       8、封闭液处理1-1.5h。

       9、加抗体（用封闭剂按1:500比例稀释），均匀地涂于切片表面，放于湿盒中，室温1-2h后4℃过夜（抗体1:500稀释于1×封闭液）。

       10、PBT洗涤3次，每次15min。

       11、显色缓冲液洗5min。

       12、滴加显色液，黑暗中显色至适度。可在显微镜下多次观察。

       13、显色终止液洗10min，双蒸水洗5次。

       14、甲基绿（0.25%）滴加染色几秒中，双真水洗5min。

       15、脱水封片。

 

注意事项：

       1 原位杂交固定的目的是为了保持细胞结构，最大限度地保存细胞内DNA或RNA的水平，使探针易于进入细胞或组织。DNA较稳定，RNA易被酶解，在RNA定位上，若要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。

       2 玻片包括盖片和载玻片用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%乙醇中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜除去所有RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。

       3 由于在手指皮肤及实验玻璃皿上均可能有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。

       4 整个实验过程中，切勿切片干燥，否则会严重影响实验结果。

 

附表1：部分试剂配制

       1 0.1mol/L三乙醇胺-0.25%乙酸酐：三乙醇胺13.2ml，氯化钠5g，浓盐酸4ml，DEPC水定容至约1000ml，临用前，一边摇动溶液一边加入乙酸酐2.5ml，充分混合。

       2 10×PBS：氯化钠 80g，Na₂HPO₄·12H₂O₂ 32.3g，NaH₂PO₄·2H₂O₂ 4.5g。加DEPC水900ml，用HCl/NaOH调pH至7.2，最后定容为1000ml。

       3 20×SSC（pH=7.0）：氯化钠175.3g，枸橼酸钠88.2g，DEPC水（ddH₂O）定容至1L。

       4 100×Denhardts：Ficoll1g，PVP1g，BSA1g，DEPC水定容至50mL。

       5 预杂交液：2×SSC，50%甲酰胺，100ug/ml变性鱼精DNA，5×Denhardts。

       6 杂交液：2×SSC，50%甲酰胺,1×Denhardts,250μg/mL酵母tRNA或100μg/mL变性鱼精DNA,10mmol/L Tris-HC1 (pH7.5)，0.5％SDS，5％葡聚糖硫酸酯，标记探针。

       7 PBT：1×PBS，0.1％Triton×100，2mg/mL BSA使用前加入。

       8 封闭液：0.1mol/L Tris-HCI pH7.5，0.15mol/L NaCI，0.5％羊血清或2％BSA。

       9 显色缓冲液：100mmol/L Tris-HCI pH9.5，100mmol/L NaCI，50mmol/L MgCl₂。

       10 显色液：4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP，用显色缓冲液配制。

       11 显色终止液：0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA。

 

附2：探针的选择与标记

1.探针选择

        特异性的探针必须是一段已知的基因片段。相对于膜上杂交而言，原位杂交有特殊性。即细胞和组织中的待测基因隐藏于类似于网络状的立体结构之中，给探针的进入带来明显的影响。探针能接触到靶分子对原位杂交尤为重要。理想的探针应满足下列要求：适当的探针长度。‚能对探针进行高效率的标记。ƒ能长期保持稳定。核酸探针多种多样，基本上可分为DNA、RNA和人工合成寡核苷酸三大类。

     （1）.DNA和RNA探针

        其原理是克隆一段特异的DNA或RNA片段，装载到相应的质粒中。经过质粒扩增，酶解和纯化等步骤，就可以得到大量的DNA和RNA片段。更好的解决办法是直接购买纯化好的探针，其次是获得一装载好特异性DNA或cDNA片段的质粒。目前在国际国内都有商品化的DNA探针供应，这些探针已经严格纯化和定量。

     （2） 寡核苷酸探针

        在待查基因序列已知的情况下，简单而又经济的用途是合成寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的长度一般为10-100bp，探针越短，渗透性越好，但结合不太稳固。探针越长则合成成本上升，也没有必要。最好是长度20-30bp的寡核苷酸探针。合成探针的时候可以掺入半抗原如地高辛、生物素和FITC等。寡核苷酸探针也可用3′末端标记法予以标记。                     

 

2.探针标记

       各种不同类型的探针需要经过恰当的标记，才能在原位杂交中应用。DNA探针一般采用的标记方法为随机引物标记和缺口平移法。寡核苷酸探针则主要采用3＇末端标记。目前标记方法分为放射性核素标记和班抗原标记两种（包括生物素）。放射性核素标记的优点是敏感性特别高，特异性也比较好。缺点是药有放射性核素有关的处理经验，存在着对人体的潜在危害性，班抗原标记的典型代表是地高辛、FITC和生物素。其最大的优点是没有放射性核素的潜在危害性，同时也有较高的敏感性和特异性。

 

（本文转载丁香园）