实验原理

       逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA到DNA）相反，故称为逆转录。逆转录过程是RNA病毒的复制形式之一，需逆转录酶的催化。逆转录过程的揭示是分子生物学研究中的重大发现，是对中心法则的重要修正和补充。人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，构建cDNA文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。在实际工作中有助于基因工程的实施，由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。

具体操作

       将 RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、5xRT Buffer、HiFiScript 和 RNase-Free Water 溶解并置于冰盒上备用。

根据以下表格配制反应体系，总体积为20ul.

       70℃孵育 10min，迅速冰浴 2min。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应液中加入以下试剂：

         50℃孵育15min，85℃孵育 5min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

        逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，加入量小于PCR反应体系的1/10,或置于-20℃长期保存。

注意事项

       1.加入各种逆转录试剂及RNA时，在冰盒上操作，以防RNA降解；

       2.加入试剂后，分别进行各阶段的水浴，确保温度、时间，已便于酶促反应完全。