超滤主要采用多孔材料，在压力驱动下将物质进行膜分离的过程，这种多孔材料成为超滤膜，那么影响蛋白超滤实验的主要因素有哪些呢？使用超滤膜处理蛋白有哪些注意事项呢？

     蛋白超滤实验的影响因素

     蛋白超滤实验中，主要会受到哪些因素的影响?超滤透过通量的影响因素如下：

     1. 料液流速

     提高料液流速虽然对减轻浓差极化、提高透过通量有利，但需要提高料液压力，增加耗能。一般紊流体系中流速控制在1-3m/s。

     2. 操作压力

     超滤膜透过通量与操作压力的关系取决于膜和凝胶层的性质。超滤过程为凝胶化模型，膜透过通量与压力无关，这时的通量成为临界透过通量。实际操作压力应在极限通量附近进行，  此时的操作压力约为0.5-0.6Mpa。

     超滤过程中只有当工作压力达到一定程度，才能使液料中的小分子 透膜分离。工作压力太小时，滤液的产量小，不能满足正常的生产。而工作压力太大时，会增加极化层的厚度，抵消增压的增速效果，同时也会把沉积在膜上的沉积层压实，难以被冲刷，膜孔很快被堵塞，影响超滤效果，此外，每一种超滤膜均有其耐压范围，使用时应在这个范围内进行。

     3. 温度

     操作温度主要取决于所处理的物料的化学、物理性质。由于高温可降低料液的黏度，增加传质效率，提高透过通量，因此应在允许的最高温度下操作。

     温度升高时可部分克服分子 间的作用力，降低粘度。同时也影响膜的工作性能，增加通透性。温度过高也会影响超滤膜的寿命。

     4. 运行周期

     随着超滤过程的进行，在膜表面逐渐形成凝胶层，使透过通量下降，当通量达到某一最低数值时，就需要进行冲洗，这段时间成为运行周期。运行周期的变化与清洗情况有关。

     5. 进料浓度

     随着超滤过程的进行。主题液流的浓度逐渐增加。此时黏度变大，使凝胶层厚度增加，从而影响透过通量。因此对主体液流应定出最高允许浓度。

     料液浓度直接影响滤速。超滤的通量与浓度的对数呈直线关系。一般来讲，随着料液浓度的增高，料液的粘度会升高，超滤时形成极化层的时间会缩短，从而使超滤的速度降低、效率也降低。因此在超滤时应注意控制料液的浓度，

     6. 料液的预处理

     为了提高膜的透过通量，保证超滤膜的正常稳定运行，根据需要应对料液 进行预处理。 预处理效果好坏，直接影响超滤膜的污染程度，系统的生产能力以及超滤膜的使用寿命。预处理一般采用高速离心法、微滤法、调PH值、热处理、冷藏法或多种方法组合进行。近年来发展起来的絮凝剂法可去除提取液中的鞣质、色素、果胶等有机大分子不稳定物质。

     7. 膜的清洗

     膜必须进行定期冲洗，以保持一定的透过量，并能延长膜的使寿命。一般在规定的料液和压力下，在允许的pH值范围内，温度不超过60。C时，超滤膜可使用12-18个月。如膜清洗不佳，回使膜的寿命缩短。

     8. 超滤膜孔径大小

     超滤膜孔径大小的选择应与药液中目标成分的大小相一致。孔径过大，则分离效果不好，杂质含量过高，影响澄明度和稳定性。孔径过小，有效成分通透率较低，损失较大。

     9. 洗脱量

     蛋白超滤膜的使用问题

     洗脱量的多少影响滤液中目标成分的含量。洗脱量太少，则留在浓缩液中的目标成分会较多，损失较大;洗脱量太大时，虽然回收率增加，但有可能需要后处理或使原有的后处理工序时间延长，应注意协调它们之间的关系。

     (一)问题：超滤膜处理蛋白时，使用前应该做哪些处理呢?

     1. 使用后应将超滤膜用0.2MNaOH处理30分钟，然后用水清洗之中性，最后保存在20%的乙醇中。

     2. 根据使用的超滤膜的性质(稳定性)，一般情况建议用0.1~0.5M NAOH,进行30分钟以上的清洗，在使用前后通过测试膜的水通量评估膜的透过性能和清洗效果。为了减少蛋白的损失，建议浓缩前用缓冲液润洗膜，浓缩后用缓冲液冲洗膜回收蛋白。并且保存膜的条件也要根据膜性质选择合适的条件。

     (二)问题：虽然知道是一次性的，但实验室的Millipore 超滤还是久经考验，用了又用。但最近超滤一个悬浊液，不慎把膜堵了，请教高手有没有在不损伤膜的前提下把堵膜的物质洗下来。(改物质可能是一些蛋白沉淀)

     1. 如果堵得比较厉害，还可以在NaOH溶液中加点NaClO效果会更好，洗膜的时候最好用热的溶液。

     2. 我用一个管子提一种蛋白的不同溶液，纯化后的分部收集管子.如果保养的好可以用很多次.一般不用时候放在乙醇中，放置染菌.　另外，容易出问题的环节主要有　滤膜破裂，套管破裂，滤膜堵塞等.我最近碰到的问题就是堵塞.楼上的方法不错，今天试用过了.另外，需要提醒你的是：滤膜过滤后，附着在膜上的蛋白量比较大，也就是说，体积的变化倍数和浓缩倍数是不一样的

     3. 可以使用 0.1-0.5 M NAOH清洗

     (三)问题：在使用之后，用水和1N NAOH 清洗完后，测得水通量也没问题。但是在把膜包从夹具拿出来准备 保存的时候 ，发现膜包边上的 小孔仍然有很多 可见杂质。

     (四)问题：我的蛋白14kD，用截流10000的怎么一点都离不下。而且在我只加超纯水时，水也离不下，十分迷惑

     你是用超滤离心管吗?水都离心不下，不是离心力不够吧，要不膜用别的什么处理过了变疏水的了。还是选错了型号。

     (五)问题：请问millipore的超滤管可以反复使用吗? 如果可以的话,第一次使用后该如何处理呢?

     为避免交叉污染，同种蛋白我想可以重复使用。

     millipore的膜，您选择的是什么材质。

     如果是PES材质，那么用后可以用0.5M NaOH浸泡，这样水通量可能会保持的久一点。

     (六)问题：目前我公司也在用millpore得超滤系统以及超滤管，也存在一些问题想咨询一下。超滤管在使用过以后应该如何维护才能延长使用寿命保证超滤效果?

 

     超滤管一般是一次性使用的，有些时候可以反复用几次，就当白赚了。

     一定要谈维护的话，在材质允许的情况下，如PES的膜，用毕可以用0.1-0.5M NaOH浸泡，有可能多用几次。

     具体millipore的材质，需要和millipore咨询

     (七)问题：请问如何选定超滤膜的孔径大小?如果我选择30kd得超滤管，那么我得到的目标蛋白应该在什么范围之内?

     那很难说，不同公司的膜孔径标称是存在明显差异的，没有通用标准。

     而且，某个蛋白的具体的截留状况和蛋白的浓度、构象、buffer种类、压力、膜材质、是否滤洗等密切相关。

     只能说，如果希望100%截留某个蛋白，一般膜孔径选择为目标蛋白的1/3-1/5。

     (八)问题：用10KD，15ml的超滤管超滤含20KD目的蛋白的蛋白溶液，会不会有目的蛋白穿过滤膜呢，我同学用这个超滤管超滤17KD的蛋白液，竟然有目的蛋白透过滤膜

     可能会有一定的透过损失，因为截留和分子的形状也有关系。

     为了100%截留, 超滤膜的截留分子量最好是目的蛋白的1/3比较保险

     (九)问题：我们公司需要的是通过超滤管的那部分液体，将我们的产品分离，我说的超滤液就是指离心以后，透过滤膜进入一次性试管中的那部分液体，而不是残留在超滤管中的那部分液体。我们的目标液体就是离心出来的那部分液体，我想知道的是，30kd的滤膜截留的应该是30000以上的蛋白质分子吧，30000一下的蛋白分子是不是就随着离心作用流入试管中了。

     滤膜的孔径并不像你想象的那样是完全均一的，事实上，膜的孔径是一个范围。膜分离的分辨率并不像你想象的那么高。只有分子量相差10倍以上的两种分子，才有可能使用膜分离技术加以分离。