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【动物实验外包服务】-自发性肥胖恒河猴的血浆脂质组学特征

  简介:肥胖患病率的增加正成为一个医学和公共卫生问题,因为肥胖与代谢异常密切相关,包括高脂血症、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、2型糖尿病(T2D)和心血管疾病。大量研究表明,肥胖在胰岛素抵抗(IR)和T2D的发生发展中起着重要作用,人们普遍认为肥胖引起的血脂异常是导致IR和T2D发生发展的主要因素,其特点是血脂含量增加,特别是三酰甘油(TG)和游离脂肪酸(FFA)T2D型。然而,将血脂异常与IR和T2D联系起来的确切机制仍然知之甚少。因此,明确肥胖引起IR和T2D的发病关键因素,尤其是在疾病进展的早期,显得尤为重要和紧迫。非人类灵长类动物(NHPs)如恒河猴(Macaca mulatta)和食蟹猴(macacafcicularis)由于在遗传学和生理学上与人类高度相似,特别适合用于生物医学研究。虽然高热量饮食很容易诱发肥胖,但许多报告已令人信服地证明,自发性肥胖在NHPs中很常见,而且它们显示出与肥胖相关的生理变化,包括腹部脂肪增加、体重指数(BMI)以及血脂异常IR和T2D,与人类相似。因此,NHPs经常被用作肥胖和肥胖相关代谢疾病的有价值的研究模型。脂质组学代表全球脂质种类的模式,并提供许多有希望的新型脂质生物标志物和有价值的信息,以阐明常见的复杂疾病(如血脂异常和肥胖症)的发病机理。随着新型检测和分析技术的出现,在血浆和组织中进行全面的脂质组分析成为可能。 以前,我们筛选了一定数量的自发性肥胖和糖尿病恒河猴。选择三只BMI为40 kg / m2或更高且年龄在12至18岁的雌性肥胖猴子,随后在1年内监测其代谢指标,它们显示出血脂异常,脂肪肝和IR,与人类早期T2D相似。在本研究中,我们对正常和自发性肥胖的猴子进行了血浆脂质体分析,以确定肥胖和胰岛素抵抗的潜在脂质生物标志物或疾病因素。

  动物和血浆样本收集:我们在先前的研究中描述了用于筛选自发肥胖猴子的标准,肥胖定义为体重指数为40 kg/m2或更高。三只个体肥胖(OB)雌性猴子和三只年龄相似(12-18 岁)的正常(CK)雌性猴子被确定用于本研究。所有猴都可以随意饮水和进食,包括21.6%的卡路里(蛋白质),5.4%(脂肪)和56.6%(碳水化合物)。用剂量为20 mg/kg的氯胺酮对猴实施安乐死。在禁食条件下,从股静脉采集血液到含乙二胺四乙酸(EDTA)的试管中,然后在3000 rpm下室温离心5 min。离心后,将血浆保存在-80°C下进行进一步研究。

  血浆脂肪酸成分的气相色谱/质谱(GC / MS)分析:按照先前报道的方法对血浆脂肪酸进行甲基化,但稍作修改。简言之,在Pyrex管中加入20μL己烷内标物,其中含有1 mg/mL庚烷酸甲酯、0.5 mg/mL三羧酸甲酯和28 mg/mL丁基化羟基甲苯(BHT),然后加入50μL血浆和1 mL甲醇/己烷混合物(4:1,v/v)。在自制的液氮浴中冷却试管10分钟后,向混合物中加入100微升预冷的乙酰氯,然后用氮气短暂冲洗。然后将试管旋盖,并避光于室温保持24小时。 将得到的混合物在冰浴中放置10分钟,然后逐渐加入2.5mL的6%K2CO3溶液(摇动)以中和。将混合物静置10分钟,并将顶层转移至玻璃样品瓶中。 将该提取过程进一步重复两次,并将合并的上清液蒸发至干。将得到的残留物重新溶解在50μL己烷中,然后进行GC-火焰电离检测器(FID)/ MS分析。甲基化脂肪酸在岛津GC/MS-QP2010 PLUS光谱仪上进行了测定,该光谱仪配备有电子冲击(EI)离子源和氢火焰离子化检测器。采用Agilent DB-225毛细管气相色谱柱(10 m,0.1 mm内径,0.1 μm膜厚),进样量为1 μL,分流比为1:60。氦气作为载体和补充气体。进样口和检测器温度均设置为230°C。柱温设置为55°C,持续1分钟,然后以30°C/min的速率增加至205°C。然后将柱温在205°C下保持3°min,然后升至230°C(5°C / min)。在EI电压为70 eV,m/z范围为45~450的条件下获得了质谱图。甲基化脂肪酸通过与37种已知标准品混合物的色谱图进行比较来鉴定,并用其质谱数据进一步证实。利用信号积分和内标的FID数据对每种脂肪酸进行定量。结果表示为每升血浆中脂肪酸含量为 μmol。使用超高效液相色谱/质谱分析血浆游离脂肪酸。使用UPLC-MS分析血浆磷脂和鞘脂。

  结果:肥胖猴的FFA水平升高:我们先前报告确定了一组自发性肥胖恒河猴,其体重、BMI、血清和肝脏TG含量显著增加,并且有轻度胰岛素抵抗。为了确定与肥胖和胰岛素抵抗有关的潜在脂质生物标志物或疾病因素,还同时收集了先前用于肝蛋白质组分析的三只肥胖(OB)和正常(CK)猴的血样,同时用于脂质组学分析。采用气相色谱-质谱联用(GC/MS)法测定脂肪酸的种类。虽然血浆总脂肪酸水平没有差异,但肥胖猴的棕榈油酸(C16:1)和花生四烯酸(C20:4)水平均显著高于正常猴。许多研究报道FFAs水平的升高与胰岛素抵抗的发病机制有关。因此我们检测了血浆游离脂肪酸水平。与正常猴相比,肥胖猴的FFA水平显著升高。与人类结果一致,在猴血浆中八种游离脂肪酸中,棕榈酸(C16:0)是主要组成脂肪酸。值得注意的是,除了C20:4和C20:5含量太低外,肥胖猴体内C16:0、C16:1、C18:1、C18:2和C20:6五种脂肪酸的含量都比正常猴高。综上所述,这些结果表明肥胖猴子的FFA水平也增加了,这与人类和啮齿动物的肥胖模型是一致的。

  血浆磷脂和鞘脂的分布:采用UPLC/MS技术对正常和肥胖猴的血浆磷脂(PL)和鞘脂(SM)进行了检测。从磷脂酰胆碱(PC),磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰肌醇(PI),磷脂酰丝氨酸(PS),磷脂酰甘油(PG),溶血磷脂酰胆碱(LPC),溶血磷脂酸(LPA)中鉴定,定量和分类了总共129种脂质 和SM。 在八类脂质种类中,PC是最丰富的脂质类别,其次是SM,LPC和PI。总之,与正常猴相比,肥胖猴的血浆PC,SM和LPA含量有所增加,而血浆PE含量则略有下降。

  肥胖猴的磷脂酰胆碱(PC)含量增加:共检测到42种PC,其中17种PC的平均浓度大于50 nmol/mL,25种PC的平均浓度小于50 mmol/mL。另外,8种含C14:0脂肪酸的PC的浓度均低于10 nmol/mL。一般来说,与正常猴相比,肥胖猴体内大多数PC种类的水平都略有增加。如上所述,肥胖猴体内的脂肪酸C16:1和C20:4水平显著升高。与正常猴相比,肥胖猴子中所有四种C20:4的PC水平,一半的C16:1的PC水平显著增加。这些结果表明,脂肪酸C20:4升高的水平可能来自PC,而不是FFA。肥胖猴的磷脂酰乙醇胺(PE)含量下降。肥胖猴的鞘磷脂(SM)含量增加。

  结论:总之,我们在恒河猴中的许多发现与啮齿动物和人类的报告一致。同时,我们还发现了一种新的脂质种类16:0-LPA,在肥胖猴体内的水平升高。这些脂质种类,尤其是FFA C16:0和16:0-LPA发生改变,可能是肥胖相关疾病的诊断和研究对象。

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