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千万别“作死”,细胞转染可以这样做

作为一条标准的实验狗,细胞转染这条路可谓是荆棘丛生,很多实验狗们看见细胞转染率低就把细胞给扔掉了!中洪小编告诉你,千万别这样“作死”,因为实验材料也很贵的啊!!科研道路十分漫长,今天我们来看看细胞转染实验大比拼。


首先我们看看细胞转染有哪些常见方式:


细胞转染途径


化学介导——利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷

DEAE

磷酸钙法

人工脂质体法

物理介导——在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA

显微注射法

电穿孔法

基因枪法

病毒介导——利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中

逆转录病毒

腺病毒


(人脐带间充质干细胞转染图,图为本公司实验图,勿盗)


小编总结了几种经典的传统方法,在此一一做一个介绍。


1、磷酸钙共沉淀


原理:该法可用于瞬时或稳定转染。然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感,所得结果容易出现差异,且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性,转染效率较差。



实验步骤:将核酸与氯化钙在磷酸盐缓冲液中混合,同时控制好pH、温度等条件 → 室温孵育,生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀 → 将颗粒型沉淀分散到细胞中,促进DNA粘附在细胞表面 → 共沉淀通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性传染。


2、人工脂质体法 


原理:带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。这种方法几乎适用于所有细胞,转染效率高、重复型好,但转染时需要去除血清,转染效果随细胞类型变化大。


实验步骤:在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂 → 脂质体与核酸的磷酸骨架结合,形成复合物 → 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合 → 复合物通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。


3、病毒转染


原理:对于用脂质体不能实现转染的细胞,可以采用病毒转染。可用于蛋白质过表达或抑制,是临床研究中最常用的方法。它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中,可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。


实验步骤:通过基因克隆生成重组病毒 → 采用非病毒法转染包装细胞系,扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞(含有病毒特异性的受体)→去除培养物中的病毒,并加入新鲜培养基→分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。


4、电穿孔法


原理:利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞。


实验步骤:将细胞悬浮于点穿孔缓冲液中,制备细胞 → 在特定缓冲液存在的条件下吗,对细胞施加合适的电脉冲 → 电脉冲在细胞膜上形成电势差,形成临时孔,使核酸进入细胞 → 使细胞恢复生长状态,复苏 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。


优缺点的比较:


优点

缺点

磷酸钙共沉淀

1.便宜且容易获得。

2.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。

3.转染效率高(不限制细胞系)。


1.需要仔细制备试剂   – CaPO4溶液对pH,温度和缓冲盐浓度的变化敏感。2.可重复性较差。

3.有细胞毒性,尤其对原代细胞。

4.不能采用RPMI培养基,由于其含高浓度的磷酸盐。

5.不适用于动物体内转染。

病毒转染法

1.高转染效率(对原代细胞有80-90%)。

2.适用于较难转染的细胞系。

3.可用于体内转染。

4.可用于构建稳定表达或瞬时表达的细胞系。


1.被转染的细胞系必须含有病毒受体。

2.基因插入大小受限(病毒载体~10 kb,非病毒载体~100 kb)。

3.技术难度高,且构建重组蛋白很费时。

4.存在生物安全问题(激活潜在疾病,免疫原性反应,细胞毒性,插入突变,使细胞恶性转化)。

人工脂质体法

1.操作快速简单。

2.结果可重复。

3.转染效率高。

4.可转染DNA,RNA和蛋白质。

5.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。

6.可用于体内转染。


1.需进行条件优化(一些细胞系对阳离子脂质体较敏感)。

2.有些细胞系不容易转染。

3.血清的存在干扰复合物的形成,导致低转染效率。

4.培养基中血清的缺失会增加细胞毒性。

电穿孔法

1.原理简单。

2.条件优化后可产生重复性的结果。

3.不需要载体。

4.不限制细胞类型和条件。

5.条件优化后可以快速转染大量细胞。


1.需要特殊的设备。

2.需要优化电转脉冲和电压参数。

3.对细胞伤害很大。

4.细胞死亡率很高因此需要大量细胞

会不可逆转地损坏细胞膜,溶解细胞。


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