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帅就一个字:悬浮细胞培养依旧魅力十足

实验方法原理


实验材料:冻存 HeLa S3 细胞


试剂、试剂盒:70% 乙醇完全 MEM-10胰酶/EDTA


仪器、耗材:旋转瓶完全培养基-525 cm2 组织培养瓶C02 培养箱Sorvall H-6000A 转子100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶和带滤膜的瓶盖


实验步骤


1. 将含有冻存 HeLa S3 细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。


2. 用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒,打开安瓿,用吸管将细胞转移到含有 5 ml 完全 MEM-10 培养基的 25 cm2 组织培养瓶中,轻轻摇动培养瓶,使细胞均匀分布于培养瓶中,放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。


3. 将培养基吸出,用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆盖细胞,消化 30~40 s。


4. 加入 10 ml 旋转瓶完全培养基-5,并将细胞转移至 50 ml 的离心管中。室温 1800 g 离心 5 min,弃上清。


5. 将细胞沉淀悬浮在 5 ml 的旋转瓶完全培养基-5 中,上下吹打,将细胞团打散。


6. 在 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶中加入 50 ml 旋转瓶完全培养基-5,并将细胞悬液转移到瓶中。


7. 取出 1 ml 细胞悬液,用血细胞计数器(附录 3F) 进行细胞计数。加入适量的旋转瓶完全培养基-5,使细胞密度为(3~4)× 105 细胞/ml。将细胞放入无 CO2 培养箱,37℃ 旋转培养。


8. 随后的两天让细胞继续生长,并且每天对细胞进行计数,加入适量的旋转瓶完全培养基-5 以维持(3~4)×105 细胞/ml 的细胞密度。


9. 取 1 ml 的细胞悬液,用血细胞计数器对细胞进行监测。


10. 当细胞密度达到(4~5)×105 细胞/ml 时,隔天或每天用培养基将细胞稀释至 1.5×105 或 2.5×105 细胞/ml。


11. 分别将装有 50 ml 或 100 ml 细胞悬液的 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶放入 37℃ 无 CO2 培养箱旋转培养。每天或隔天传代。


注意事项: 由于有些细胞是不能被养活的,所以需要高的初始密度。


其他:HeLa S3 细胞用旋转瓶完全培养基-5 在通气旋转瓶中于 37℃ 无 CO2 培养箱生长和维持。细胞用新鲜的旋转瓶完全培养基-5 每天或隔天进行稀释,以保持细胞的密度为(1.5~5)×105 细胞/ml。


细胞活力的测定


(1)相差显微术法 在显微镜下, 根据细胞质环流和正常细胞核的存在与否,即可鉴别出细胞的死活。 利用相差显微镜可以得到更明显的图象,但在亮视野显微镜下常常也不难进行这样的观察。


(2)二乙酸荧光素 (FDA) 法: 应用这种方法可以对活细胞百分数进行快速的目测 , 首先用丙酮制备 0.5%的 FDA 贮备液 , 置 0℃下保存。当要测定细胞活力时, 将贮备液加到细胞悬浮液中, 加入的数量以使最终浓度为 0.01%为准。混匀,在室温下作用 5 分钟,然后在带有适当的激发滤片和吸收滤片的荧光显微镜进行观察。FDA本身无荧光、无极性,可自由透过细胞质膜进入内部,进入后由于受到活细胞内脂酶的分解,而产生有荧光的极性物质荧光素, 它不能自由出入质膜。 在荧光显微镜下可观察到产生荧光的细胞, 表明是有活力的细胞; 相反,不产生荧光的细胞,表明是无活力的死细胞。 细胞活力以发绿色荧光的活细胞数占总观察细胞数的百分数表示。


(3)伊文思兰染色法:这种方法可用做FDA的互补法。当伊文思兰的稀薄溶液 (0.025%)对细胞进行短时间的处理, 只有活力已受损伤的细胞能够摄取这种染料, 而完整的活细胞不能摄取这种染料。 因此,凡不染色的细胞皆为活细胞。 但是染色时间不能太长, 否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色。 细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数表示。


实验问答


问:悬浮细胞一般几天离心一次,觉得好难养啊!求心得?


答:你养的是什么细胞,原代吗?我觉得悬浮细胞最好养了,不用消化,关于几天离一次心,要看你的细胞生长状态了,我养过血液肿瘤细胞,增值比较快,我一般是第二天半量换液(加等量培养基后一分二),第三天若长得比较满,就离心换液。若你不想每天都去管它,你可以把细胞密度中的相对稀一点(不能太稀,太细了细胞不好好长),可以2-3天换一次液(半量,不用离心),这要看细胞状态,和你试验进度,若你急着用细胞,那就将细胞中密一点,天天换液,用胎牛血清,这样细胞会疯长的。要是比较娇气的细胞,象RPMI-8226,一定要用胎牛血清,2-3天半量换液,依据细胞状态再离心换液,等细胞进入对数生长期了,养起来也就好养了。若是正常人T细胞,也要3-5天换一次液,最好3天的时候加入些新培养基,我曾经有一次1周忘了换液(因为T细胞增殖很慢,或者说在体外不给刺激基本不增殖,所以培养基的颜色不发生改变,但它也消耗营养),最后作流式发现细胞大部分凋亡和死亡了。


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