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细胞转染的常用方法

1.磷酸钙共沉淀


原理:该法可用于瞬时或稳定转染。然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感,所得结果容易出现差异,且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性,转染效率较差。


实验步骤:将核酸与氯化钙在磷酸盐缓冲液中混合,同时控制好pH、温度等条件 → 室温孵育,生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀 → 将颗粒型沉淀分散到细胞中,促进DNA粘附在细胞表面 → 共沉淀通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性传染。


2.人工脂质体法 


原理:带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。这种方法几乎适用于所有细胞,转染效率高、重复型好,但转染时需要去除血清,转染效果随细胞类型变化大。


实验步骤:在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂→ 脂质体与核酸的磷酸骨架结合,形成复合物 → 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合 → 复合物通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。


3.病毒转染


原理:对于用脂质体不能实现转染的细胞,可以采用病毒转染。可用于蛋白质过表达或抑制,是临床研究中最常用的方法。它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中,可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。


实验步骤:通过基因克隆生成重组病毒→ 采用非病毒法转染包装细胞系,扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞(含有病毒特异性的受体)→去除培养物中的病毒,并加入新鲜培养基→分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。


4.电穿孔法


原理:利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞。


实验步骤:将细胞悬浮于点穿孔缓冲液中,制备细胞→ 在特定缓冲液存在的条件下吗,对细胞施加合适的电脉冲 → 电脉冲在细胞膜上形成电势差,形成临时孔,使核酸进入细胞 → 使细胞恢复生长状态,复苏 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。


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