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TNF成品生物活性的测定的操作流程

1. 材料和试剂

 

     1.1培养液A :DMEM 培养液添加10%的胎牛血清(FBS)。

 

     1.2培养液B:DMEM培养液添加10%的胎牛血清(FBS)和终浓度为0.7--1μg/ml的放线菌素D。

 

     1.3 L929细胞株:鼠结缔组织纤维母细胞,来源于22天雄性C3H鼠皮下组织。

 

     1.4 结晶紫染色溶液:0。05%结晶紫 (50mg结晶紫加入20ml乙醇,加蒸馏水定容至100ml),蒸馏水稀释。

 

     1.5 脱色液:(1)乙二醇独甲醚50%,蒸馏水稀释。

 

     (2)乙醇50%,乙酸0.01%(V/V),蒸馏水稀释。

 

     1.6 胰酶:消化贴壁L929细胞。

 

     1.7 半效稀释度TNF标准品:1000IU/ml。

 

2. 实验用具

 

     超净工作台,细胞培养 烘箱,酒精灯,显微镜,细胞计数器,微量移液器,细胞培养板,细胞稀释槽,酶标仪。

 

3. 操作步骤

 

     3.1样板:弃L929细胞培养瓶中的培养液,加入800—900μl胰酶消化细胞,细胞收缩后,弃胰酶,加入4ml培养液A,吹打细胞,混匀,用细胞计数板在显微镜下计数,并计算所需细胞总数,培养液体积,将消化好未贴壁的细胞重新悬浮于完全培养液A,并调整细胞浓度为10×104/ml左右并将细胞接种于96孔培养板中,每孔100μl,37°C,5%CO2培养过夜或24小时,待细胞贴满板壁80%以上时,方可加样。

 

     3.2 样品处理和稀释:将待测样品和标准品用培养液B溶解至1 ml,(样品为冻干粉状)。如标准品为1000IU/ml,10倍稀释至100IU/ml作为起始浓度,样品则根据实际情况都做10倍梯度稀释,并以最低浓度定为起始浓度(以上操作均在24孔板中操作)。


     从样品和标准品中的起始浓度中取200μl加入到96孔板A2-A12中,其余各孔均加入150μl培养液B,再从A2-A12中各取50μl,对B-H各排进行逐级四倍梯度稀释.


      3.3 加样:标准品和样品经稀释后,吸去已经培养好的细胞培养板中的上清液,每孔依次加样100μl,并在边缘未加样的各孔加入100μl培养液B,消除边缘效应,放入烘箱37°C,5%CO2,培养过夜。


     3.4 染色和脱色:L929细胞培养过夜后,镜检在半数死亡孔到达D或E时终止反应,吸取上清,轻轻吹打2—3次,除去死细胞,每孔加入染色液30μl,静置5分钟左右。


     用流水轻轻冲掉染色液,每孔加入100μl脱色液脱色,轻轻摇动使脱色完全,然后于酶标仪 570nm波长下比色,测O.D.值,并设对照.

 

     4. 处理数据:在座标纸上以570nm O.D.值(双孔加样测两点值的平均)对稀释倍数做图,并以标准品的最低,最高O.D.之平均值做一平行于X轴的直线交各曲线,以各相应曲线与该直线交点在X轴上读出半效量的稀释度,按下式计算效价:


     TNF成品活性(IU/ml)=标准品效价*(样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数)*(标准品半效量稀释度/样品相当于标准品半效量的稀释度)

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