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超高效电转化细胞的制备、电击及要点——经过实践检验可靠适用

1.细菌电转化感受态细胞的制备

 

1)由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落,过夜培养16-20hr。晚上将将新鲜的菌落接种于2ml-5mlSOB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜,转速控制在180rpm。


2)第二天,取过夜培养物250uL转接入含50ml SOB培养基(1:200)的500mL摇瓶中,37℃剧烈振荡 (300rpm)培养至OD600约为0.72-0.76,将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷。


3)用两个预冷的50ml离心管于4℃ 2000g离心10分钟。收集菌体,弃上清。


4)用预冷的水(纯净双蒸水,高压蒸汽灭菌)轻轻重悬菌体,先加入少量水重悬菌体,然后把水加满,4℃ 2200g离心10分钟,弃上清。


5)再用10%甘油重复步骤4)两次,2400g离心10分钟,最后一次倒尽上清后,用残存管底的甘油悬浮细胞,分装ep管,100ul/支(一般,25ml起始培养物最终用200-250uL10%甘油悬浮)。


6)放入液N2中速冻,保存于-70℃。

 

注意


1) 菌种最好是-70℃冻存的,活化后生长状态较好。


2) 2ml培养过夜,震荡速度不要过高(一般应该是37度,300rpm,6hr,当天转接,这样一天内工作量太大,这里我们选择过夜培养,时间长,转速控制在180rpm, 可以适当缩短时间,前一天晚接种,第二天早转接)


3) 培养完毕后一定要骤冷,使培养物在短时间内迅速冷却。冰水混合物中摇动瓶子,大约10分钟。


4)所使用得器皿一定要非常干净,没有化学物质残存,可以先用餐洗净洗,再加入NaOH固体和蒸馏水产热,最后用蒸馏水反复冲洗干净。注意pH值检测。


5)培养完毕后得离心操作一定要低温,所用的水和甘油,离心管都要冰上预冷。


6)整个过程尽量不要用枪吹打。


7)器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配制。


8)控制好菌体的OD600值,我用JM109操作时值为0.727和0.757时都获得非常高效的转化率。而0.83时转化率明显降低。根据季节不同JM109达到相应OD值


所需时间有所差异2.5hr-3hr45min。


9)最后一次务必倒尽上清后,用残存管底的甘油悬浮细胞,一般每管仅剩200uL左右。切务用过多甘油液悬浮细胞,我曾用350-500uL10%甘油/25mL出发菌液,导致细胞浓度下降,电转效率低2-3个数量级。

 

2.电转化protocol1


1) 将电击杯冰上预冷 ,冻存的感受态细胞取出冰上融解


2) 30ul感受态细胞,加入1ul纯化的连接液(或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液),冰上放置60s-90s


3) 将混合液加入预冷的电击杯, 注意擦干杯外的水,防止电火花


4) 3kv,200欧姆,25uF(我们用的是BioRad 电转化仪,0.2电转化杯),时间常数应该在4.5-5ms之间(其值越大,说明感受态细胞中离子去除越彻底。) 电击


5) 加入1ml 37度保温的SOC,将混和液洗出,此步有热击的作用,室温进行


6) 37度震荡培养1-1.5hr,可适当延长时间,使其充分表达抗性


7) 涂板

 

注意


1) 电击之前保持低温状态。


2) 连接液要纯化,去除离子,ddH2O溶;或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液,切务过多以免电火花,我曾试过0.3uL和0.6uL连接液的加入细胞做对比,转化效率相当。


3) 原核生物受体细胞电击以15kv/cm 场强为最佳,电击电压根据电击杯厚度选择


4) 电击杯使用完,用针头蒸馏水反复冲洗杯底,再用70%乙醇浸泡,4度存放,使用前烘干即可。或者烘干后,-20度冰箱存放。


5)37度震荡培养时间切务过长,否则会有很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。我曾培养1hr45min即出现上述卫星菌落和轻微的菌膜干扰。

 

试剂配制(重蒸水配制):


SOB:2.0%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉、0.05%NaCl完全溶解搅匀,加入2.5mMKCl 并用NaOH调PH7.0,灭菌后加入过滤除菌的MgCl2备用;


实际配制100mL时:2g bacto-trptone、0.5g bacto-yeast extract、0.05g NaCl完全溶加0.0186g KCl,10N NaOH一小滴即可调至PH7.0 分装入50mL培养基/500mL瓶高压灭菌;此后50mL中加入250uL 2M MgCl2即为SOB培养基;


SOC:50mL无菌SOB培养基+1mL 1M 过滤除菌的葡萄糖即为SOC,分装1mL每管,冻存于-20备用。


10%甘油:用分子生物学级别的甘油。

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