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CCK-8细胞增殖与毒性检测法

一、CCK-8实验原理:


全称为Cell Counting Kit-8,在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被细胞内脱氢酶还原成水溶性的甲臜染料,生成的(橙黄色)甲臜量与活细胞数量成正比,即颜色的深浅与细胞的增殖成正比。因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 


二、优点:


1、使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂;

2、CCK-8法能快速检测;

3、CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;

4、CCK-8法的重复性优于MTT 法,MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的,需要使用DMSO 等有机溶剂溶解;

5、而本方法产生的formazan 是水溶性的,不仅省去了溶解步骤,更因此而减少了该操作步骤带来的误差;

6、CCK-8法对细胞毒性小,可以多次测定选取最佳测定时间,与MTT 方法相比线性范围更宽,灵敏度更高;

7、CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。


三、缺点:


与MTT相比,CCK-8和MTS的价格贵。


四、实验材料及试剂


96孔板、CO2培养箱、酒精灯、移液枪、酶标仪等;细胞、CCK8等。


五、实验内容


实验一:细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。

2、向每孔加入10 μL CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。


实验二:细胞增殖-毒性检测

1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。

2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。

4、向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

7、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。


注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。


三、注意事项


1、CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。

2、在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。

3、CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。

4、当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。

5、一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。

6、在培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。

7、在做加药实验时,还应考虑药物的吸收,可在加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。

8、金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。

9、悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

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