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MTT(四唑盐)比色法二

注意事项:


1.  选择适当得细胞接种浓度。


2.  避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。


3.  设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。


MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!


举个例子:


各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入计算公式:
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025


参考公式:


lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm: 最大阳性反应率
Pn: 最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率


例:


用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200 ul 1640,20 u lMTT,150 ul DMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定,一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20 ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150 ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。


1.  选择适当得细胞接种浓度。


2.  避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。


3.  设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。


MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!


举个例子:


各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入计算公式:
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025


参考公式:


lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm: 最大阳性反应率
Pn: 最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率


例:


用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200 ul 1640,20 u lMTT,150 ul DMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定,一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20 ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150 ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。


一、经验总结


1.  首先细胞的接种密度一定不能过大,一般每孔1000个左右就够了,我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了,这样即使药物有作用,MTT方法也是表现不出的,最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。



2.  MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手,20%的波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的,特别是种板技术一定要过关。


3.  我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.


4.  注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练,尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多,但是如果操作不熟,CV会在8%左右。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。


二、实验心得分享


1.  吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的3-4倍,可能比较容易混匀。10 ml的离心管里面最好装3-4 ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。
 
2.  吸管的吸液量最好在1 ml左右:吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量1 ml多的吸管,总液量在5 ml左右为益。
 
3.  吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。
 
4.  吹打次数100左右,就可以吹打均匀了(有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟,然后再以一定的速度吸取悬液。)
 

5.  向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央,而周边很少,这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中,向左3下,向右3下,在往返回复3下移动,目的是使得细胞能分散的均匀些。(铺板技术是MTT实验的关键,也是基础,一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,最后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细胞。


(本文转载丁香通)




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