—— co-IP 检测 Hsp90 与 Cdc37 结合情况

1、实验材料

      SKBR3 细胞，PMSF（Amresco，cat:329-98-6），cocktail，脱脂奶粉（cat:66196131T），β-actin。Anti-Hsp90(santa,cat:sc-69703)、Anti-Cdc37(santa,cat:sc-13129)、Protein A+G agrose(Beyotime)，细胞刮，4 度离心机（eppendorf，centrifuge 5415R），摇床（ORBITAL SHAKER，TS-1000），电泳仪（Tanon EPS300）。低速离心机（cat:TDZ4B-WS）。

2、实验方法

制样：

      • 细胞裂解液配制：基础裂解液中加入 PMSF，cocktail 和 DTT

      • 实验分组：Control 组 、化合物 11（10μM）、化合物 11（20μM)、化合物 11（40μM），给药时间 24 h。

      • 弃培养上清，PBS 洗一遍，冰上加入 150ul/孔裂解液。

      • 于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

      • 裂解完后，于 4℃ 下 12000rpm 离心 15 min。

      • 收集蛋白上清，取少许裂解液用于后续检测各蛋白表达情况。

      • 剩余的裂解液加入 Anti-Cdc37，4℃ 缓慢摇晃孵育过夜。

      • 用适量裂解缓冲液预处理 ProteinA+G，20uL/管加入各抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4℃ 缓慢摇晃孵育 2~4 h。

      • 免疫沉淀反应后，4℃，3000rpm，3 min，小心吸取上清，琼脂糖珠用 1 mL 
      • 裂解液冲洗 3-4 次，最后加入 15uL 2*SDS 上样缓冲液，100℃，5 min。

      • Laemmli-SDS-PAGE

电泳：

      电泳时根据情况每块胶 15mA 恒流电源；根据预染 Marker 和目的蛋白的分子量大小的相对位置判断最佳跑胶时间，以使目的蛋白处于分离胶面的下 1/3 的最佳分辩位置。

转膜：

      • 将 PVDF 膜放到甲醇中浸泡 2 min

      • 将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫，再添加 2 层湿润的滤纸，将 SDS-PAGE 胶小心地铺在滤纸上，表面再覆盖大小合适的 PVDF 膜；然后再覆盖两层湿润滤纸，再垫上湿润的海绵垫，将红色的正极板合上，夹好，插入转膜槽相应的位置。

      • 转膜过程在 4℃ 进行，采用 100V/100mA。

      • 丽春红染色：转膜过程完成后，将膜从转膜夹中取出，立即投入丽春红染液中染色，大约染色 5 分钟后将膜由丽春红中取出，用清水轻轻冲洗膜，注意观察膜上的红色条带，当条带足够清晰后停止水洗，根据染色条带把膜适当剪小，留出目的蛋白所在的范围。然后用清水彻底冲洗膜，尽可能洗去残留的丽春红，使得条带消失。

封闭：

      一般抗体采用 5% 脱脂奶粉+TBST 封闭；封闭时间为室温下一个小时，在摇床上进行。

一抗杂交：

      在一个 1.5 ml 的 EP 管中加入 1 ml 的封闭液（5% 脱脂奶粉+TBST），再加入适量的一抗，置于 4℃ 冰箱中过夜。

洗膜：

      将过夜杂交的膜从塑料袋中取出，投入含有足量体积 TBST 的洗膜盒中，于摇床上清洗，每次 10 分钟，连续 3 次。

二抗杂交：

      处理步骤类似一抗杂交步骤，不同之处在于二抗杂交可在常温下，1 小时内完成。二抗比例控制在 1:2000～1:5000。

显影：

      将膜平放于干燥的平面上，将新鲜配置好的 ECL Reagent 滴加到有铅笔记号标注的膜面上，反应 5 分钟后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的 ECL Reagent，将膜放到化学发光仪中收集信号。

（本文转载丁香园）