从 GenBank数据库上搜索获得 GeneA基因的mRNA序列。

       从 网站 www．invitrogen.com/mai获取工具用来设计 miRNA。

       选择 GeneA基 因 mRNA序列中21nt片段为合适miRNA靶序列。

       结合线性化pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体(Invitrogen公司)的特点，设计4个64nt的pre-miRNA寡核苷酸序列，该序列针对 GeneA基因不同区域，并且得到寡核苷酸序列互补的序列，经NCBI Blast的相似性搜索，排除其非特异同源性部分。

       其结构为 5’-TGC TG overhang + G + antisense target sequence+ miRNA loop + Sense target sequence-3’。

       将4对合成好的oligo进行退火。

       将退火的4条双链oligo用T4DNA连接酶与酶切后的线性载体连接。

       取连接反应物转化 DH5α菌株，挑选阳性克隆质粒，PCR鉴定与培养。

       利用小量提取试剂盒小提质粒，经 PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，取阳性克隆菌液送公司测序鉴定。