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实验专栏丨步骤不能再精细!细胞复苏、传代及冻存


细胞复苏、传代及冻存实验步骤:

     一、准备
     无菌超净台,酒精灯,75%酒精喷壶,CO2培养箱,37℃水浴锅,离心机;培养瓶,含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液(提前放置超净台使平衡到室温),无菌工作服(白大褂),口罩,手套,记号笔
     二、步骤
     1、穿好无菌工作服,带上口罩和手套,快速从液氮里取出冻存管,快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻,注意冻存管的封口膜不要破裂,防止污染。
     2、解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴,酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。
     3、开超净台,点燃酒精灯燃烧片刻后(可提前准备),冻存管放超净台,换新手套,小心打开冻存管,避免污染,无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管,补加9ml基础培养基稀释,1000rpm,离心5min使细胞沉淀,弃上清。
     4、加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml,轻轻混匀,用吸管将细胞移至25T培养瓶。
     5、平躺放置培养瓶,8字形混匀后,置于37℃,5%CO2培养箱培养。
     6、培养24小时后,显微镜观察细胞(贴壁细胞)贴壁后,小心更换培养基,继续培养,根据不同细胞的生长状态进行传代培养,培养瓶上标记:操作者,时间,细胞类型。
     7、有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染,但是这对于掌握细胞培养是非常不利的,不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。一旦细胞出现污染,易于发现,一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃,以免污染同实验室其他细胞。
     8、细胞长满90%-100%即可传代,小心打开培养瓶,瓶口过酒精灯消毒,弃培养基。
     10、加入1mlPBS,润洗细胞,重复3次,弃PBS。
     11、加入4ml完全培养基,用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。
     12、转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶,各瓶补加完全培养基至4ml。
     13、小心封口,平躺放置培养瓶,8字形混匀后,置于37℃,5%CO2培养箱培养。
     14、待长满后,按同样的方法传代培养。

     三、冻存
     当不需要使用细胞或者细胞量足够时,可以将细胞冻存起来,供以后实验用

     四、准备
     细胞冻存液(20%血清、10%DMSO、70%基础培养液),梯度降温盒

五、步骤
     1、选取活力好,密度约70%细胞用于冻存,此时细胞处于对数生长期,最适合用于冻存。
     2、细胞吹打或者胰酶消化后,转移至无菌EP管,1000rpm里面5min。
     3、弃上清,加入新鲜配制的细胞冻存液,25T细胞可以加入2ml细胞冻存液,分装2个冻存管,细胞最佳密度为5*106-1*107个每ml。
     4、做好标记,放入梯度降温盒(提前平衡至室温)。
     5、将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜,第二天取出冻存管,快速放入液氮保存。

     遵循“快速复苏,缓慢冻存”的原则。

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