CRISPR/Cas9的现状如何呢？距离建 立高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术还有哪些路要走？
复旦大学生命科学学院王永明研究员，他是这么认为的：
CRISPR/Cas9技术是2013年发展起来的基因编辑技术，被认为是继锌指酶(ZFN)、TALEN之后的第三代基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统包括两个元件，分别是Cas9内切酶和guide RNA(gRNA)，gRNA引导Cas9蛋白在靶位点进行切割，形成 DNA双链断裂(DSB)。细胞的修复系统修复双链断裂的DNA时，会定点产生突变，这就是基因编辑。如果想改变不同的位点，只需要表达相应的gRNA就行了。细胞修复DNA主要依靠两种途径，分别是非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。非同源末端连接是高效的修复途径，修复系统对DNA末端做简单的修饰后重新连接在一起。这个过程经常会产生碱基的插入或缺失（indel），如果indel发生在编码区，就有可能造成移码突变，使基因失去功能，这种方法用于敲除基因。研究人员通常将表达Cas9和gRNA的质粒转染到感兴趣的细胞中来制作基因敲除的细胞模型。在转染效率高的细胞系如HEK293中，编辑效率一般在10-30%左右。有的细胞转染效率低，编辑效率也低，如在人的胚胎干细胞中编辑效率为1-25%。这时可以通过流式细胞分选仪将转染成功的细胞分选出来提高效率。我们最近利用附着体载体表达Cas9和gRNA，同时表达嘌呤霉素抗性基因，既可以长期编辑细胞，又可以富集转染成功的细胞，这是目前最高效的基因编辑技术，这种方法只适合于基因的敲除，在胚胎干细胞中效率最高可达到100%。
同源重组途径需要提供一个同源模板供体，可以是质粒或者单链DNA。DNA双链断裂处把供体遗传信息拷贝过来修复基因，这种方法的优点是可以精确的改变DNA序列，缺点是效率低。如何提高同源重组是基因编辑领域的一个重大挑战。利用质粒当作供体，同时加上一个筛选基因，这种方法的效率还是非常高的，但是制作供体工作量大，编辑后还要去除筛选基因，整个实验周期长。这种方法显然无法用于基因治疗，因为质粒供体无法导入体内细胞中。短的单链DNA oligo也可以做供体，合成DNA oligo成本低，速度快，同源重组后不存在去除筛选基因的步骤。但是这种方法重组效率很低，除了几种容易转染的细胞，在大多数细胞中难以检测到编辑成功的细胞。有几篇文章报道他们通过加小分子化合物或者优化oligo的设计方案得到了很好的编辑效率，但是我们的实验结果表明效率依然不理想。同源重组效率和编辑位点所处的基因组位置有很大的关系，有的位点容易发生同源重组，有的不容易。调控DNA修复途径可能会提高同源重组，但是目前提高的效果有限，调控DNA修复途径还会增加基因组突变的风险。所以如何提高同源重组还有很长的路要走。
基因编辑已经应用到多个领域，吸引了很多的优秀人才开始尝试将基因编辑技术应用于人类各个行业的发展。针对CRISPR的局限，剪切导致的脱靶以及只能利用病毒载体运送DNA，现在有什么可行的解决方法么
脱靶剪切是大家都关注的一个问题，脱靶剪切的原因是基因组中有很多和靶向序列非常相似的序列，这些序列容易被识别切割从而产生突变，如果这些序列有功能的话，会引发疾病。科学家已经发明了一些降低脱靶的技术，一个是double-nicking技术，就是在Cas9上引入一个点突变，使得Cas9只能切断DNA双链中的一个链，同时表达两个gRNA，在DNA双链上分别产生一次切割，形成双链断裂，这就降低了脱靶。还有一种方法是在Cas9上引入几个突变，降低Cas9蛋白和DNA的非特异性结合，也可以有效的提高脱靶切割。这些技术在降低脱靶的同时，也降低了编辑效率。实际上，如果设计的gRNA序列在基因组中非常特异的话，脱靶效率是非常低的。包括我们在内的数个实验室通过实验均表明在干细胞中很难检测到脱靶。之前的几个课题组在研究脱靶时，选用的gRNA在基因组中都有非常相似的序列，这就造成了脱靶效率高的现象。在做基因治疗时，突变拷贝和正常拷贝往往只有一个碱基的差异，这时候确实存在很高的脱靶，需要谨慎编辑。在体内进行基因编辑治疗时，目前最有效的方法是利用病毒载体将CRISPR/Cas9系统导入细胞内。AAV病毒能够组织特异性的感染细胞，免疫排斥反应小，最具有治疗前景。一部分科学家在发明用化学试剂转染体内细胞，这种方法除了要克服转染效率低的问题，还要克服对细胞毒性大的问题。
