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用于荧光原位杂交的石蜡切片预处理方法

试剂:


2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, Sigma)、丙酮、二甲苯、酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite )、蛋白酶K、2XSSC、0.1M HCl、70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇


预处理程序


1.  将载玻片浸入2% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 丙酮溶液中5分钟,随后在丙酮及蒸馏水中漂洗,自然干燥载玻片。


2.  从福尔马林固定石蜡包埋组织中获取多块4微米切片,分别置于以上经氨基烷基硅烷(aminoalkylsilane)处理过的载玻片上。


3.  将组织切片置于65℃下过夜烘烤。


4.  将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次,每次10分钟,随后浸入100%乙醇中5分钟。


5.  将组织切片依次室温置于100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各两分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水中3分钟,用无绒纸巾吸取多余的水分。


6.  50℃下用30%[w/v] 酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite )处理组织切片20-30分钟。


7.  于2XSSC溶液中漂洗2次,每次5分钟


8.  取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 20XSSC(pH 7.0)得到蛋白酶K工作液(200µg/ml);将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中,37℃下孵育20-30分钟。


9.  组织切片经蛋白酶K消化后,于2XSSC溶液中漂洗2次,每次5分钟。


别说明:



为确保消化充分,可以自然干燥组织切片,将15µl DAPI复染剂滴加于组织切片区域,立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟后,在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察消化情况。


如果消化过度,可放弃本次FISH实验,选择新的组织切片重复实验,缩短蛋白酶K消化时间;如果消化不充分,可将组织切片浸泡在2XSSC溶液中帮助脱落盖玻片,盖玻片脱落后,于2XSSC溶液中漂洗2次,每次5分钟,然后将组织切片置于37℃蛋白酶K工作液中继续消化5-20分钟;如果消化适中,可将组织切片浸泡在2XSSC溶液中帮助脱落盖玻片,盖玻片脱落后,于2XSSC溶液中漂洗2次,每次5分钟,继续第9步实验操作。


10.  将组织切片置于0.1M HCl中室温浸泡5-10分钟,于2XSSC溶液中漂洗2次,每次5分钟。


11.  将组织切片玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2分钟脱水。


12.  将组织切片室温浸入丙酮溶液中2分钟。


13.  自然干燥玻片。


14.  加热玻片至56℃。


15.  按照FISH操作步骤进行FISH实验。


(本文转载丁香通)

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