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激光共聚焦实验服务案例介绍


实验试剂:PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4)(实验室常规配置);非免疫山羊血清;Triton X-100(sigma);BSA抗体稀释液(实验室常规配置);A蛋白抗体(Santa cruz);B蛋白抗体(Abcam);Alexa Fluor® 488 donkey anti-goat IgG (H+L)(Invitrogen);Alexa Fluor® 555 Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment(Invitrogen)


实验仪器:激光共聚焦扫描显微镜(LeicaTCS-SP5型)


实验步骤: 将细胞每孔2ml(密度为2*106/L)传至激光共聚焦专用培养皿;接种24h后,采用刺激物处理;25min后培养皿内细胞培养液,PBS冲洗3次,2-4%甲醛固定15min;1×PBS缓冲液(0.01M,pH7.4)洗涤3次,每次5min,滴加非免疫山羊血清(内含0.3%Triton X-100)封闭液,覆盖液面2-3mm,室温放置60min,除去多余液体;加A蛋白一抗50μL(1:100),4℃下过夜;PBS洗3次,每次5min,加荧光标记的A蛋白二抗 [Alexa Fluor® 488 donkey anti-goat IgG (H+L)] 50μL(1:200),室温下放置60min;PBS冲洗3次,加B蛋白一抗50μL(1:500)37℃下放置1h,PBS洗3次,每次5min;加荧光标记的B蛋白二抗[(Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment)] 50μL(1:200),置于室温下 60 min;PBS洗3次,每次5min;激光共聚焦显微镜下观察、拍照,每组照相2张,用MOTIC FLUO1.0生物荧光分析处理软件将图片进行量化  

实验分组:刺激物分4组。培养液中刺激物的终浓度:刺激物L0.5ng/ml;刺激物S20nM;刺激时间25分钟
  1组:control(DMEM培养液)
  2组:刺激物L
  3组:刺激物S 
  4组:刺激物L+S


(本文转载生物通

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