实验方法原理    

      GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

实验材料  微生物动物细胞植物组织

试剂、试剂盒 RNA  提取试剂盒焦碳酸二乙酯乙醇

仪器、耗材  恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽

实验步骤

一、细胞或组织破碎

 

1.  微生物材料

 

      （1）发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。

 

      （2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。

 

      （3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。

 

      （4）研磨后的样品转移至12 ml 变性液的容器中匀浆。

 

2.  动植物细胞培养材料 （适用的样品量为细胞：108）

 

      （1）细胞或组织培养：按常规方法进行。

 

      （2）深层悬浮培养细胞的破碎。

 

      ①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3 000 g 离心5分钟。

 

      ②细胞洗涤：上步沉淀用25 ml 灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3 000 g 离心5分钟。

 

      ③细胞破碎：在沉淀细胞中加入15 ml 预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。

 

3.  表面培养细胞的破碎

 

      （1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。

 

      （2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8 ml 预冷变性液。

 

      （3）转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。

 

      （4）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。

 

      （5）直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。

 

      （6）将上述12 ml 含细胞的变性液转移至一50 ml 无菌离心管中，匀浆破碎细胞。

 

4.  植物组织破碎 （适用的样品量为0.05 g 组织）

 

      （1）将600 ul 变性液置于1.5 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

 

      （2）将0.05 g 新鲜组织用液氮冰冻。

 

      （3）在液氮下，研磨组织块。

 

      （4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。

 

5.  动物组织破碎 （适用的样品量为1 g 组织）

 

      （1）将12 ml 变性液置于50 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

 

      （2）在上述管中加入1 g 新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。

 

二、RNA 的抽提

 

      1.  在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。

 

      2.  600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

 

      3.  冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。

 

      4.  上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。

 

      5.  离心4℃，10 000 g，20分钟。

 

      6.  沉淀RNA ，冷冻干燥15分钟 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。

 

      7.  60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。

 

      8.  600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。

 

      9.  冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。

 

      10.  上层水相吸至无菌离心管中。

 

      11.  等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥。

 

      12.  复溶于去RNA 酶的水中（对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。）。

  （本文转载丁香园）