做ChIP的心得体会
发布人：admin
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发布时间：2016-09-19
做ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）已经几个月了，虽时间不长，但深刻体会细节决定成败，这里就把自己认为值得注意的细节总结如下：
1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。
2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。
3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。
4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。
5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。
6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。
7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）
8、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。
9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。
10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。
11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。
12、一个ChIP一般需要3~4天的时间，其中有几个步骤是可以停下来的：
1）细胞收集：用含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤离心，去上清的细胞收集液可置-80°冻存；
2）用SDS重悬细胞后可置-80°冻存；
3）sonication结束，离心后的上清置新的离心管后可-80°冻存；
4）reverse cross-link后的标本可-80°冻存。
13、agarose beads 的wash过程中以及后面的DNA提取过程中乙醇的wash，可以用细胞室的那种吸引器，接上200ul的tip头吸，这样会节省很多时间（每个实验室情况可能不一样）。
14、DNA提取后建议用水溶解DNA，因为TE buffer里的EDTA可能会影响PCR反应体系中的Mg2+。
15、溶解DNA的水量可以根据PCR反应体系的要求适当调整。
