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原位杂交技术,你看透它了吗?

一. 实验原理及背景


原位杂交可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。


菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂解以释放DNA。将DNA烘干固定于膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。


组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需要裂解细菌释放DNA,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。


二. 具体步骤

1、将加入探针的杂交液先于50℃预热,均匀涂于切片表面,加上硅化盖玻片,放于湿盒中,50℃孵育12-16h。


2、1×SSC(含50%甲酰胺),50℃洗涤2次,每次10min。


3、2×SSC(含50%甲酰胺),37℃洗涤10min。


4、2×SSC(0.5ug/ml RNaseA),37℃洗涤30min。


5、1×SSC,50℃洗涤10min。


6、1×PBS(含0.1%Tween20),50℃洗涤2次,每次10min。


7、PBT室温洗涤10min。


8、封闭液处理1-1.5h。


9、加抗体(用封闭剂按1:500比例稀释),均匀地涂于切片表面,放于湿盒中,室温1-2h后4℃过夜(抗体1:500稀释于1×封闭液)。


10、PBT洗涤3次,每次15min。


11、显色缓冲液洗5min。


12、滴加显色液,黑暗中显色至适度。可在显微镜下多次观察。


13、显色终止液洗10min,双蒸水洗5次。


14、甲基绿(0.25%)滴加染色几秒中,双真水洗5min。


15、脱水封片。



三、注意事项


1、 原位杂交固定的目的是为了保持细胞结构,最大限度地保存细胞内DNA或RNA的水平,使探针易于进入细胞或组织。DNA较稳定,RNA易被酶解,在RNA定位上,若要使RNA的降解减少到最低限度,取材后应尽快予以冷冻或固定。


2、 玻片包括盖片和载玻片用热肥皂水刷洗,自来水清洗干净后,置于清洁液中浸泡24h,清水洗净烘干,95%乙醇中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干,烘箱温度最好在150℃或以上过夜除去所有RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存放。


3、 由于在手指皮肤及实验玻璃皿上均可能有RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在整个杂交前一日置高温(240℃)烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶,其最低温度必须在150℃左右。


4、 整个实验过程中,切勿切片干燥,否则会严重影响实验结果。



四、部分试剂配置


1、 0.1mol/L三乙醇胺-0.25%乙酸酐:三乙醇胺13.2ml,氯化钠5g,浓盐酸4ml,DEPC水定容至约1000ml,临用前,一边摇动溶液一边加入乙酸酐2.5ml,充分混合。


2、 10×PBS:氯化钠 80g,Na2HPO4·12H2O2 32.3g,NaH2PO4·2H2O2 4.5g。加DEPC水900ml,用HCl/NaOH调pH至7.2,最后定容为1000ml。


3、 20×SSC(pH=7.0):氯化钠175.3g,枸橼酸钠88.2g,DEPC水(ddH2O)定容至1L。


4、 100×Denhardts:Ficoll1g,PVP1g,BSA1g,DEPC水定容至50mL。


5、 预杂交液:2×SSC,50%甲酰胺,100ug/ml变性鱼精DNA,5×Denhardts。


6、 杂交液:2×SSC,50%甲酰胺,1×Denhardts,250μg/mL酵母tRNA或100μg/mL变性鱼精DNA,10mmol/L Tris-HC1 (pH7.5),0.5%SDS,5%葡聚糖硫酸酯,标记探针。


7、 PBT:1×PBS,0.1%Triton×100,2mg/mL BSA使用前加入。


8、 封闭液:0.1mol/L Tris-HCI pH7.5,0.15mol/L NaCI,0.5%羊血清或2%BSA。


9、 显色缓冲液:100mmol/L Tris-HCI pH9.5,100mmol/L NaCI,50mmol/L MgCl2。


10、 显色液:4.5μL/mL NBT,3.5μL/mL BCIP,用显色缓冲液配制。


11、 显色终止液:0.1mol/L Tris-HCl pH8.0,10mmol/L EDTA。

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