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重组胰蛋白酶最适温度和温度稳定性

     样品:重组胰蛋白酶,比活 4000USP u/mg pro.,上海雅心生物技术有限公司,纯度如图 1 所示。BAEE,Sigma.

 

    图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定

 

    1. 最适温度的研究

 

     将底物 BAEE(0.25 mM)分别置于 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中温浴 20 min,加入相同体积的 RPT 酶液测定 rPT 的活力,结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。


     2. 温度稳定性的研究

 

     取 10 mg/ml RPT 纯酶液稀释 10 倍后,分别置于 4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃,70℃ 水浴中温浴 2 h,每隔 20 min 取样测定酶活,结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。

 


      图 2. a, RPT 最适温度曲线;                       b, RPT 的温度稳定性

 

     把底物分别放置在 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中,然后加入同体积的纯酶液测活。图 2a 显示,温度越高,测得的酶活也就越高。60℃ 酶反应速率很快,酶活最高,然而温度继续升高,胰酶的自水解加剧,酶活性损失加快。

 

     把酶液分别放置在 4℃、15℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中温浴,每隔 20 min 检测残余酶活,得到 rPT 的热稳定性曲线,如图 2b 所示。4℃ 条件下 rPT 相对最稳定,2 小时内酶活残余率在 97% 以上;随着温度的升高,分子的结构发生了变化,分子间碰撞加剧,导致酶结构遭到破坏,rPT 的降解速率也随之加快。50℃ 条件下 2 小时内酶活残余还能达到 60% 左右;60℃ 条件下 2 小时内酶活残余还能达到 10% 左右,而 70℃ 时 20 min 之内胰蛋白酶就会完全失活。

 

     3. 重组胰蛋白酶运输条件下的稳定性

 

     试剂:

 

     1、重组胰蛋白酶冻干粉(批号:RPT1305001)

 

     2、测活缓冲液: 25 mmol 三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液(pH7.6),含 100 mM NaCl,5 mM CaCL2。

 

     3、0.001M HCl:取稀释至 1M 的 HCl, 稀释 1000 倍即得,pH3-4。

 

     4、底物溶液(2.5 mmol/L):精密称取 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)(Sigma)42.8 mg,加入相应 50 ml 体积的测活缓冲液,使其溶解,即为 2.5 mmol/L 的底物母液,现配现用, 使用时,用测活缓冲液 10 倍稀释。

 

     5、供试品:精密称取待测样品适量。平行分装 3 支,置于蓝冰保温运输箱内,室温下放置。

 

     实验方法:

 

     1、重组胰蛋白酶运输条件下的稳定性:样品测定活性,作为初始活性。蓝冰于-20℃ 充分预冷后,取出,与样品同时放入泡沫保温运输箱内,同时放入温度记录仪,2 日后,取出,测定活性,取平均值。以初始时酶活定为 100%,以残余酶活百分比表示测定结果。


     实验结果:

 

     运输过程中的温度变化曲线如图 3 所示。

 


     结论:重组胰蛋白酶在蓝冰保温箱内保持低温的条件下运输稳定。活性无损失,活性保持为 100%。

 

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