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体外DNA重组技术

     在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子,再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。

 

     DNA重组技术的基本程序包括:

 

   (1)获得外源DNA:外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段,一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。

 

   (2)载体的构建或选择:分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的DNA分子,例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等,常用的载体一般为质粒;根据需要可直接从公司购买合适的载体,也可以自己构建。

 

   (3)连接:目的DNA片段和适当载体的连接,一般采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体,使它们的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所用内切酶的切割特点不同,产生三种连接方式:粘端连接、平端连接和不相配的连接。

 

   (4)转化:将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞,使其在宿主细胞内复制扩增或表达,赋予宿主细胞新的生物特征。

 

   (5)克隆化:重组DNA分子转化大肠杆菌后,在平板培养基上筛选出单个菌落,此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。

 

    下面以质粒为例图示DNA体外重组的基本程序:

 

    一、基因组DNA的制备

 

    【实验目的】

 

    1. 理解生物细胞基因组DNA制备方法的原理。

 

    2. 熟悉组织细胞基因组DNA制备的基本操作。

 

    【实验原理】

 

     在阴离子去污剂(SDS-十二烷基硫酸钠)以及酚/氯仿/异戊醇作用下可以使细胞膜破坏,核蛋白质变性,将染色体DNA分离出来。

 

    【实验对象】

 

     新鲜哺乳动物组织或细胞。

 

    (一)从哺乳动物组织中提取基因组DNA

 

    【实验试剂与器材】

 

     1. 消化缓冲液:100mM NaCl,10mM Tris.Cl (pH8.0) 25mM EDTA (pH8.0),0.5% (w/v) SDS,0.1mg/ml蛋白酶K。

 

     2. 7.5mol/L乙酸铵。

 

     3. 100%乙醇。

 

     4. 酚/氯仿/异戊醇。

 

    【实验方法与步骤】

 

     1. 将新鲜组织剪成小块并立即置于液氮中冻存;

 

     2. 将200mg~1g的组织用预冷的研钵研碎,或用锤子将其捣为细粉末,每100mg组织用1.2ml消化缓冲液悬浮,然后于50℃摇荡温育12~18h;

 

     3. 用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品,1700×g,离心10min。如果样品溶解得不好,再加1体积不含蛋白酶K的消化缓冲液,重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质,重复抽提一次,将上层(水溶液)转移至一个新离心管中;

 

     4. 加入1/2体积7.5mol/L乙酸铵和2倍体积100%乙醇,12 000rpm离心2min;

 

     5. 用70%乙醇洗涤,晾干,沉淀用TE缓冲液或无菌双蒸水重新溶解,使终浓度在约1mg/ml。注: 加入0.1%的SDS和1?滋g/ml无DNA酶的RNA酶,37℃温育1h,以除去残留的RNA。

 

     6. 重复步骤4、5。1g细胞大约能提取到2mg DNA。

 

    (二)从植物组织中提取基因组DNA

 

    【实验试剂与器材】

 

     1. CTAB抽提液:2% (w/v) CTAB (十六烷基三甲基溴化铵),100mM Tris.Cl,pH8.0,  20mM EDTA,pH8.0,1.4M NaCl

 

     2. CTAB/NaCl溶液:10% CTAB,0.7M NaCl 配制方法:在80ml双蒸水中溶解4.1g NaCl,然后缓慢加入10g CTAB (十六烷基三甲基溴化铵),同时加热并搅拌,可加热至65℃溶解,定容终体积至100ml。

 

     3. CTAB沉淀液:  1% (w/v) CTAB,50mM Tris.Cl (pH8.0),10mM EDTA(pH8.0)

 

     4. 高盐TE缓冲液:  10mM Tris.Cl (pH8.0),0.1mM EDTA (pH8.0),1M NaCl

 

    【实验方法与步骤】

 

     1. 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巯基乙醇,使终浓度达2% (v/v)。将此溶液及    CTAB/NaCl溶液加热至65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2-巯基乙醇/CTAB抽提液和0.4~0.5ml的CTAB/NaCl溶液;

 

     2. 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷冻匀浆器,将植物组织粉碎成为细粉,然后将冷冻的组织转移到一个含有机溶剂的试管或烧瓶中;

 

     3. 往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润,于65℃温育10~60min,期间不时混匀;

 

     4. 用等体积的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液,上下颠倒充分混合,7500×g,4℃,离心5min,回收上层水相;

 

     5. 加入1/10倍体积的65℃预热CTAB/NaCl溶液,上下颠倒混匀;

 

     6. 用等体积的氯仿/异戊醇抽提,混匀,离心,回收上层水相;

 

     7. 加入1倍体积的CTAB沉淀液,上下颠倒混匀,如果沉淀可见,继续做步骤8,也可于65℃温育30min;

 

     8. 500×g,4℃,(或约2700rpm)离心5min;

 

     9. 移出上清,用高盐TE缓冲液重悬沉淀(按每克起始材料加0.5~1ml),如果沉淀很难溶解,于65℃温育直至所有的或大部分沉淀溶解;

 

     10. 加入0.6倍体积异丙醇沉淀核酸,充分混匀,7500×g,4℃,离心15min;

 

     11. 用75%乙醇洗涤沉淀物,干燥,用尽可能少的TE或水重悬(每克起始材料0.1~0.5ml)。

 

    【注意事项】

 

     基因组DNA分子量大,所有操作必须轻柔,酚/氯仿对皮肤有腐蚀作用,应该戴手套操作。

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