小泛素相关修饰（SUMO）是生物内极为重要的一种蛋白翻译后修饰方式，是一类广泛存在于真核生物中且高度保守的蛋白质家族，它在调节蛋白质间相互作用、定位、转运、转录、细胞周期以及拮抗泛素化等方面均发挥着重要的作用。

SUMO修饰是指SUMO共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上，类似于泛素化但又不同于泛素化。SUMO通常是非活性的前体形式存在，在酶作用下水解几个氨基酸暴露出C端双甘氨酸残基，成为具有活性的SUMO分子。当ATP存在时，经SUMO活化酶E1、SUMO结合酶E2、SUMO连接酶E3的连续作用，最终与靶蛋白底物耦联形成异肽键，完成底物的SUMO修饰。

SUMO背景介绍：

SUMO化修饰与一些重要疾病相关联。SUMO 化能影响淀粉样前体蛋白产生淀粉样β肽(A β),其机制尚不清楚。过表达SUMO23,诱导SUMO化 蛋白增加可抑制ʌβ的产生,过表达SUMO232K11R (其参与形成多SUMO链的赖氨酸残基敲除)则可 产生相反的效应,说明单SUMO化可增强ʌβ的形成,而多SUMO化则抑制ʌβ的形成。多聚谷氨酸(polyQ)重复扩增可引起何杰金氏病(HD)、脊髓小脑共济失调、Machado2Joseph病和 延髓脊髓性肌萎缩等神经退行性疾病。研究显示,患这些疾病的患者受损脑区神经元SUMO21染色增强,说明SUMO化修饰也参与调节polyQ的重复扩增。应用HD果蝇模型证明Huntingtin(Htt)的polyQ区的一个片段,既可被SUMO化,又可被泛素化。泛素化可消除神经退行性变,然而SUMO化则可加剧神经退行性变。SUMO化的Htt稳定,不易聚集,具有较强的抑制转录能力。SUMO化促进可溶性毒性Htt寡聚体的聚集,通过抑制转录而 介导神经退行性变。

1、感受态细胞的制备

（1）准备LB培养基：0.5%酵母浸提物、1%胰蛋白胨、1%NaCl(PH 7.0),高压灭菌，4℃保存备用。

（2）准备LB琼脂平板：取新鲜配置的100-200ml的LB培养基，加入1.5g琼脂糖，高压灭菌，冷却至60℃，液体倒入已消毒的平皿中，凝固后4℃保存备用。

（3）无菌条件下，用接种环蘸取少量大肠埃希菌DH5a或IM109菌液，在不含抗生素的LB琼脂糖平板上划线，37℃过夜培养。

（4）从LB平板上挑取一个单菌落，放入含2mlLB培养基的试管中，37℃恒温摇床220rpm振荡培养过夜。

（5）取500ul菌液，转入含50mlLB培养基的培养瓶中，37℃恒温摇床180rpm振荡培养至OD600=0.8-1.0。

（6）7000g，4℃，离心5min收集细胞。

（7）用25ml预冷50mmol/L CaCl2 溶液重悬细胞，冰浴30min。

（8）6000g，4℃，离心5min收集细胞。

（9）用4ml预冷100mmol/L CaCl2 溶液重悬细胞。

（10）加入1ml甘油混匀，100ul/冻存管分装，-80℃保存备用。

2.SUMO基因重组质粒的转化及扩增

（1）取10ngSUMO基因重组质粒，加入50ulDHα或JM109感受态细胞。

（2）冰浴30min 到42℃水浴，热休克60-90s 到冰浴5min。

（3）在试管中加入950ul不含抗生素的LB培养基，37℃恒温摇床220rpm振荡孵育40-60min。

（4）4℃4000g，离心2min收集细胞。

（5）取20ul菌液放入含抗生素LB琼脂糖平板，将细菌均匀涂至整个平板表面。

（6）37℃恒温培养箱中培养16-24h。

（7）试管中加入2-5ml含抗生素的LB培养基，挑取单克隆菌落放入试管。

（8）37℃恒温振荡培养过夜。

2.SUMO质粒DNA的提取

（1）用1.5ml离心管取少量菌液，离心后弃掉上清液。

（2）用250ul P1溶液重悬菌株，漩涡振荡使菌液重新完全悬浮。

（3）加入250ulP2溶液，轻轻涡旋4-6次混匀。

（4）加入350ulN3溶液，轻轻涡旋4-6次混匀。

（5）13000rpm（或17900×g）离心10min。

（6）用移液枪轻轻吸出上清放入QIAprep spin柱中，放置1-2min。

（7）13000rpm离心30-60s，弃滤液。

（8）500ul PB缓冲液，13000rpm 离心30-60s，弃掉滤液。

（9）加入750ul的PE缓冲液，13000rpm离心30-60s，弃掉滤液。

（10）13000rpm再次离心1min，甩干残留液体。

（11）将QIAprep spin柱置于一个新的1.5ml离心管中，加入50ul的EB溶液，室温放置10min。

（12）13000rpm离心1min，管底即为质粒DNA。

（13）检测质粒DNA的浓度。

（14）-20℃保存备用。

3.SUMO质粒瞬时转染

（1） 将生长状态良好的细胞接种于直径4-6cm的培养皿中，5% CO2，37℃培养箱内培养16-24h，细胞融合至60%-90%时可进行转染。

（2） 转染前1h将细胞培养液换成不含抗生素的培养液。

（3） 用Opti-EME培养液稀释4倍的Lipo2000试剂。

（4） 用Opti-EME培养液稀释SUMO质粒。

（5） 将上两步溶液按1:1比例混合配成转染复合液，室温，孵育20min。

（6） 将已接种细胞的培养皿中加入200ul转染复合液，充分混匀。

（7） 继续培养4-6h，更换正常培养液。

（8） 培养24-72h，镜下观察和检测带有荧光标记的SUMO质粒的表达。

4.带标签的SUMO的制备（以His-SUMO为例）

（1）培养细胞、诱导及收获。

（2）每200ml菌液收获的菌体加入5ml His裂解液，重悬沉淀。

（3）冰浴条件下，超声破碎沉淀。

（4）4℃，10000rpm，离心1h

（5）取上清液，加入Ni-NTA agarose，4℃，混合1-2h。

（6）将混合物装柱用His洗涤液洗涤，直到检测不到蛋白浓度。

（7）His洗脱液进行洗脱，按洗脱次序每管收集500ul。

（8）考马斯亮蓝染色检测蛋白。

5.SUMO化蛋白的检测

（1）培养细胞，待细胞融合至90%左右。

（2）PBS洗涤细胞2次，0.25%胰酶消化细胞。

（3）1000rpm，离心3-5min收集细胞。

（4）PBS洗涤细胞2次。

（5）1000rpm，离心3-5min，弃掉上清液。

（6）加入50ul细胞裂解液，冰浴10min。

（7）4℃，12000g，离心15min。

（8）取上清液，检测蛋白浓度。