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病毒空斑实验问答

       问:我准备做病毒空斑实验,不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液,敬请各位指教 


       答:1、我是这么做的: 

  
       24孔板VEROHSV1


       124孔板预板


       224h后,弃培养液,用hanks液洗1


       3)接种病毒液0.1ml/


       4)放入375CO2培养箱1h,期间每15min慢摇一次,使病毒充分吸附


       5)加入1%甲基纤维素(1ml/)孔覆盖培养基,放入375CO2培养箱继续培养


       63天后,吸弃培养基


       7)加入5%甲醛1ml/孔固定4min,弃甲醛,加入结晶紫0.8ml/孔染色20min


       8)自来水缓缓冲洗染液,计算孔斑数 


       2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素,不过浓度是2%,配置方法是:甲基纤维素:3克溶于150ml蒸馏水中,最终浓度为2%;染色用的碘液:25g溶于500ml95%的乙醇中。最终浓度为5%做出的效果很好。不过甲基纤维素要提前很长时间配置,大约2周,高压后放入冰箱,使用前无菌操作加入培养液,混匀放入冰箱,过一天后再拿出,使劲摇匀,使纤维素达到一种匀质的状态,静置至起泡完全消失后使用。 染色可以用中性红0.1%w/v)温箱孵育2-3小时,若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。


       问:1%甲基纤维素(1ml/)孔覆盖培养基,放入375CO2培养箱继续培养是指把1%甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里,还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中?配方比例是什么?甲基纤维素要提前很长时间配置,大约2周为什么?什么时候可以计数了?以什么为标准呢? 


       答:11%甲基纤维素(1ml/)孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。因甲基纤维素难溶,所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分,注意MEM 配的是10×的,这样要加的MEM 溶液体积就少的多。我按protol配好Viscous medium其最后总体积约 400 ml,所以10× MEM只需40 ml。其他成分所加量按配400 ml 培养基换算就是了。所以甲基纤维素和培养基不是分开的,甲基纤维素只是这种培养基里的一种成分而已。


       至于什么时候可以计数要看感染后CPE出现情况,这个要看具体测的病毒,刚开始每天坚持观察并计数就是了,直到没新的斑出现,大概都应在一周内吧。这个做一遍就可摸索出来。


       2、我也用Viscous medium做病毒空斑实验,甲基纤维素覆盖培养液具体配方如下,供参考:In a glass bottle, combine 8.8 g methyl cellulose (4000 centipoise ,Sigma) with 320 ml distilled water. Stir with a large magnetic stirrer. Autoclave 30 min at 121 ℃, leaving the magnetic stirrer inside the bottle. Remove from autoclave while still hot and stir again until methyl cellulose has completely dissolved (usually a few hours).Add 40 ml 10× MEM or 10× DMEM, 40 ml FBS, 40,000 U penicillin, 40 mg streptomycin, and 4 ml of 1 M HEPES. Add L-glutamine and sodium bicarbonate according to the medium supplier's recommendations. Store up to 6 months at -20℃.配置此 Viscous medium 确实挺麻烦,所用试剂多, 甲基纤维素是难溶解,不过我按上述方法大概两三天内也溶好了。只要配好了甲基纤维素溶液,其他步骤都简单了。


       问:还想请教,不管用什么培养基,怎么灭菌?用高压的话 琼脂拿出来后很快就凝固了呀 要是高温就加进去 细胞会被烫死的,那个琼脂稍微加热溶解一下都很快凝固的,请指教。


       答:可用低熔点琼脂糖呀,压完后放在42度保温培养基37度保温,用时混合半小时内不会凝的。我做的空斑实验就是用的低熔点琼脂糖,效果很好。当然也是文献推荐的因为我是做杆状病毒-昆虫表达系统的,上层覆盖物只是防止病毒随液体扩散。


      (本文转载网络)

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