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免疫荧光细胞化学染色方法,你会做吗?


免疫荧光细胞化学染色方法  


一、标本制作  可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经适当固定或不固定,作免疫荧光染色用。  


二、荧光抗体染色方法


➤ 直接法  


1.染色 切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如1:8或1:16的荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等),在室温或37℃染色30min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥。  


2.洗片  倾去存留的荧光抗体,将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次,搅拌,每次5min,再用蒸馏水洗1min,除去盐结晶。


3.用50%缓冲(0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5)甘油封固、镜检


4.对照染色  


①正常免荧光血清染色,如上法处理切片,结果应为阴性。


②染色抑制试验(一步法):将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致,可用盐水代替未标记抗血清,染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。


③类属抗原染色试验,前面已作叙述。  直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,特异性高而敏感性较低。


➤ 间接法


(1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。  (2)再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。


对照染色:


①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。


②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。


③阳性对照。 间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。


另一种称夹心法,即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:


①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。  


②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。


③缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。  


④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃,30min。


⑤如③水洗。  


⑥缓冲甘油封固,镜检。 


间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原,敏感性较高,操作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。


➤ 补体法


1.材料


(1)免疫血清60℃灭活20min,用Kolmers 盐水作2倍稀释成1:2,1:4,1:8……。补体用1:10稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光抗体等,按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价,如为1:32则免疫血清应作1:8稀释。


(2)补体用新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按2单位的比例,用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中,溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。


(3)抗补体荧光抗体:在免疫血清效价为1:4,补体为2单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。


2.方法步骤  


(1)涂片或切片固定。  


(2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液(此时免疫血清及补体又都稀释一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定湿度的染色盒内。


(3)用缓冲盐水洗2次,搅拌,每次5min,吸干标本周围水液。 (4)滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min,37℃,水洗同(3)。


(5)蒸馏水洗1min,缓冲甘油封固。


3.对照染色


(1)抗原对照。  


(2)抗血清对照:用正常兔血清代替免疫血清。  


(3)灭活补体对照:将补体经56℃30min处理后,按补体同样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行补体法染色。

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