新浪微博
微信互动

PCR引物设计法则、特殊PCR技术、PCR产物电泳结果分析和经验总结



pcr引物设计的11条黄金法则 


一、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 


   DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。 


二、引物长度一般在15~30碱基之间。 


   引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 


三、引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。 


   GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 


四、引物3′端要避开密码子的第3位。 


   如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。 


五、引物3′端不能选择A,最好选择T. 


   引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T. 


六、碱基要随机分布。 


  引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G 或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 


七、引物自身及引物之间不应存在互补序列。 


   引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 

两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Cross dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 


    引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。  


八、引物5′ 端和中间△G值应该相对较高,而3′ 端△G值较低。 


   △G值是指DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高,而3′ 端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3′ 端的△G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。(不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析) 


九、引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。 


   引物的5′ 端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。 

引物的延伸是从3′ 端开始的,不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。 


上一篇:RT-PCR实验方法大全
下一篇:多重PCR反应中关键因素和实验步骤
分享到: