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原位PCR实验老出错,听听老司机怎么说?

标本的制备


原位PCR技术可应用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片以及石蜡切片。相比较而言,以悬浮的完整细胞做原位PCR效果最好,石蜡切片效果最差。


注意:要防上细胞、组织标本在原位PCR操作过程中脱落。


①承载标本的载玻片要涂以多聚赖氨酸或进行硅烷处理;


②多聚赖氨酸用消毒蒸馏水配置,使浓度为lmg/ml;


③分装后-20℃冰箱保存。


④涂片时先在载玻片的涂面用铅笔或钻石笔做上标记,再将一小滴PLL溶液(约5μl)滴在玻片上,用另一玻片的边缘象制备血涂片那样将PLL均匀地在玻片上涂上一薄层。


⑤1-2 min后,PLL薄层即干燥,玻片收藏备用。


组织细胞的固定


步骤:以10%的缓冲福尔马林或4%的多聚甲醛固定后进行原位PCR;


固定的时间:一般不宜过长,视组织的大小,一般以4℃4-6小时为宜。 


预处理制备好的组织标本


原理:经蛋白酶消化的组织细胞,可增加其通透性,充分允许反应体系中的各成分进入细胞内,并能很好的暴露靶序列,以利于扩增。


常用的蛋白酶有:蛋白酶K,胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根据组织固定的程度进行调整。


注意事项:蛋白酶消化后,要加热以灭活酶的活性或通过充分的洗涤将酶完全去除,因为只要有少量的残留酶存在,都将对随后进行的PCR反应体系的数量TaqDNA酶产生毁灭性的影响。 


原位扩增


原位扩增也即在组织细胞标本上进行PCR反应,其基本原理及反应条件与液相PCR相同,但由于PCR是在固定的细胞组织标本上进行,所以也有其特殊性。


1、引物:PCR所用的引物一般为15-30bp为宜,扩增的片断为100-1000bp左右。原位PCR宜用较短的引物。在原位PCR组织标本制备过程中,DNA和RNA常有一定程度的降解。尤其是存档组织的石蜡切片,DNA和RNA的降解就更明显。从蜡块组织中提取的DNA,很少超过400bp,RNA 则不超过200个碱基。


2、反应体系:原位PCR的反应体系与常规的液相PCR基本相同,由于是在经过固定的组织切片上进行,为获得较好的扩增效果,有人主张反应体系中的引物,TaqDNA聚合酶以及Mg2+的浓度均应高于液相的PCR反应体系。在反应体系中要加入牛血清白蛋白(BSA),以防止TaqDNA聚合酶与玻片的结合而降低了扩增效率。 


3、热循环:原位PCR的热循环可在专门的热循环仪上进行,操作简便。也可在一般的PCR热循环仪上进行,通常在样品台上覆盖一层铝箔,制成平台,样品台上的空间用矿物油或水充填,将载玻片至于平台上,即可进行热循环的步骤。 


后处理


原位扩增结束后,标本应清洗,以除去弥散到细胞外的扩增产物。洗涤不充分,会导致扩增产物在检测时显现,造成背景过深或假阳性结果的出现。但是,洗涤过度,也会造成细胞内扩增的产物被洗脱,是阳性信号减弱或丢失。 


有的研究者在标本原位扩增后,用多聚甲醛(4%,2h)或戊二醛(2%,5 min)进行后固定,以使扩增产物在随后的检测过程中能保留在细胞内,提高检测的敏感性和特异性。要注意的是后固定应适度,过强的后固定会影响原位杂交检测时探针与特异性扩增产物的结合。


原位检测


原位PCR的扩增产物检测方法,取决于原位PCR的设计方案,直接法则根据标记分子的性质对扩增产物直接进行原位检测。间接法则需用原位杂交的方法进行检测

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